Nato a Asciano, studiò legge a Bologna e fu in seguito lettore (1516 e 1517) di diritto civile nello Studio di Siena. Datano a questo periodo una Laude delle donne bolognesi (Bologna, I. e Rubera, 1514) e un dialogo De corruptis verbis iuris civilis (Siena, S. Nardi, ca. 1516). Ascritto all'Accademia detta "grande" e quindi all'Accademia degli Intronati, nel 1518 fu allontanato dalla città e riparò a Roma dove poté coltivare i suoi interessi letterari. In occasione della polemica sulla riforma ortografica suscitata dalla pubblicazione dell'Epistola de le lettere nuovamente aggiunte ne la lingua italiana del Trissino (1524), compilò il dialogo Il Polito (stampato sotto pseudonimo di Adriano Franci a Roma, da Lodovico Vicentino e Lautitio Perugino, nel 1525) nel quale sostenne lucidamente la necessità di un sistema grafico di tipo fonologico, ossia basato sulla esclusiva dipendenza della "scrittura" dalla "parlatura". Intorno al 1525 compose anche la sua opera più nota, il dialogo Il Cesano de la lingua toscana (princeps Venezia, Giolito de' Ferrari, 1555), che articola in un sistema organico le tre direttrici fondamentali del suo pensiero linguistico: quella diacronica (predilezione per l'uso moderno rispetto all'antico), quella diafasica (predilezione per la lingua viva rispetto alla lingua letteraria) e quella diastratica (attenzione alla parlata popolare e alle differenze rispetto all'uso colto). Nello stesso periodo probabilmente il Tolomei iniziò la stesura di altri più brevi trattati grammaticali, che proseguì fino agli anni '40 e dei quali si conserva una trascrizione manoscritta (Biblioteca Comunale di Siena, cod. H VII 15) approntata per volere di Uberto Benvoglienti da due o più distinti antigrafi (uno dei quali appartenuto a Celso Cittadini e conservato oggi alla Biblioteca Labronica di Livorno). Di questi trattati l'unico edito è quello Del raddoppiamento da parola a parola (a cura di B. Garvin, Exeter 1992). Al periodo romano risalgono anche l'Oratione de la pace (Roma, A. Blado, 1534), compilata per il cardinal Ippolito de' Medici al servizio del quale il Tolomei era nel frattempo entrato; l'operetta Versi et regole della nuova poesia toscana (Roma, A. Blado, 1539), che riassume le discusse ricerche condotte dal Tolomei e dagli altri membri dell'Accademia della Virtù per applicare al verso volgare la metrica latina, e la stampa dei sette libri delle Lettere (Venezia, Giolito de' Ferrari, 1547), che suscitarono polemiche a Siena per le posizioni prese dall'autore in materia di politica interna. Rientrato in patria, partecipò alla cacciata degli spagnoli a seguito della quale fu mandato dalla Repubblica presso la corte di Enrico II per implorarne la protezione (1552). L'ambasciatore rimase a Parigi per tutta la durata della guerra, pronunciando diverse orazioni che furono poi date alle stampe: soltanto nell'autunno del 1555 fece ritorno a Roma dove poco dopo morì.